咖啡發酵濾液的工藝及抗老機制研究
引言Introduction
咖啡作為世界三大飲品之一，其研究一直備受關注，但大多集中在風味與品質方面。HBN 生物實驗室創新性以綠咖啡豆為原料，利用混合菌株發酵得到咖啡發酵濾液用於化妝品中。研究證明，該濾液是一款對人體皮膚安全且具有良好的抗氧化活性和延緩皮膚衰老功效的創新原料。
01 研究背景Research Background
「咖啡」是一種由烘焙過的咖啡豆製成的飲料，與可可和茶一樣，在全球廣受歡迎。綠咖啡，就是常見咖啡豆被烘焙之前的形態，也被稱作，生咖啡（raw coffee）。咖啡首次傳入中國可以追溯到 1898 年，並廣泛種植在雲南、廣西、廣東和海南等地區[1]。咖啡豆因其神奇的功效而被記錄在許多本草書籍中。《中華本草》記載：咖啡微苦、微澀、性平，具有醒神、利尿、健胃的作用，主要用於治療精神疲勞和食欲不振。它被用作醒神劑、利尿劑和健胃藥[2]。近年來，國內外的咖啡研究主要集中在品種、種植管理以及烘焙等產業鏈前端。揮發性成分是評價咖啡風味的主要標準之一，重點研究微生物發酵對咖啡風味質量的影響[3,4]。此外，對咖啡的工藝研究主要集中在咖啡烘焙和咖啡中化合物的提取，而咖啡在化妝品領域的應用報道較少。HBN 生物實驗室利用發酵方法提取綠咖啡豆中的活性成分，研究發酵對綠咖啡豆主要成分的影響，評估驗證咖啡發酵濾液的護膚功效和穩定性。這為開發和應用咖啡發酵產物作為化妝品原料或成品提供了理論與技術基礎。
02 研究結果Research Results
①咖啡發酵濾液工藝開發
圖 1 不同工藝條件下咖啡發酵濾液中有效成分含量及 DPPH 自由基清除能力。
（A）不同菌种下發酵濾液 DPPH 自由基清除情況；（B）不同培養條件下，發酵濾液中多肽、多酚及 DPPH 自由基清除情況。
⏵研究表明，通過微生物發酵法提取植物活性成分，提取率和利用率更高[5]。本研究通過對比植物乳桿菌、釀酒酵母單菌發酵以及混合菌種對咖啡發酵濾液的主成分變化和體外活性影響，結果表明相對單一菌發酵而言，複合發酵更具有優勢。圖 1A 中顯示，採用不同菌種得到的發酵濾液在同樣抗氧化條件下，混菌的用量最少，僅為 2.5%，其次是單菌 -1，最後是單菌 -2。進一步通過對接種量、培養基成分、生長條件優化，以有效活性成分為指標，製備出有效成分含量高和抗氧化功效強的咖啡發酵濾液。圖 1B 中結果顯示，工藝 -3 和工藝 -4 得到的咖啡發酵濾液中多肽及多酚的含量較高。進一步對這兩種工藝進行 DPPH 自由基清除實驗後，發現工藝 -3 的活性較工藝 -4 活性提高 8.8%。結合以上結果由此確定咖啡發酵濾液的最終工藝。
②發酵對咖啡中活性物質含量的影響
⏵發酵前後樣品中總酚、多肽和總黃酮含量變化，如表 1 所示。其中，與咖啡提取液對比，咖啡發酵濾液中總酚含量提升 7.1 倍、多肽含量提升 5.8 倍、黃酮含量提升 4 倍。DPPH 自由基清除能力是咖啡提取物的 4 倍。根據微生物的生長代謝特點，造成含量提升可能是由於發酵過程中微生物分泌的酶類破壞了植物細胞壁，從而提高了咖啡發酵濾液中活性成分的含量。
③咖啡發酵濾液功效檢測
咖啡發酵濾液抗氧化活性
圖 2 咖啡發酵濾液抗氧化活性。（A）羥基自由基清除率；（B）DPPH 自由基清除率
咖啡發酵濾液對羥自由基清除影響如圖 2A 所示，實驗條件下，體積分數 80% 的咖啡發酵濾液對羥自由基的清除率為 92.39%。咖啡發酵濾液對 DPPH 自由基清除作用如圖 2B 所示，體積分數 5% 咖啡發酵濾液對 DPPH 自由基有較高水平的清除作用，高達 94.38%，2.5% 體積分數即可清除 92.02% 的自由基，1.25% 體積分數的咖啡發酵濾液能夠清除 50% 自由基。表明低濃度的咖啡發酵濾液在抗氧化活性方面具有較強的作用。
咖啡發酵濾液抗衰老功效
圖 3 咖啡發酵濾液對成纖維細胞中的影響。（A）咖啡發酵濾液對成纖維細胞活性的影響；（B）咖啡發酵濾液對成纖維細胞的膠原蛋白 -Ⅰ 含量的影響；（C）咖啡發酵濾液對成纖維細胞的彈性蛋白含量的影響；（D）咖啡發酵濾液對成纖維細胞的 MMP-1 含量的影響。
⏵隨著年齡的增長，人體皮膚成纖維細胞數量下降，這與皮膚產生皺紋、衰老密切相關。如圖 3A 所示，0.5% 體積分數的咖啡發酵濾液對成纖維細胞沒有毒性，細胞存活率在 80% 以上（85.13%），並選定 0.5% 作為後續細胞實驗濃度。皮膚中的彈性和韌性與其所含有膠原蛋白含量密切相關。如圖 3B 和 3C 所示，與陽性對照 VC（0.25mg/mL）對比，咖啡發酵濾液可以促進膠原 -Ⅰ 和彈性蛋白的合成，同時對 MMP-1 的表達抑制作用顯著（如圖 3D）。
。
④咖啡發酵濾液的皮膚安全性評價
表 2 咖啡發酵濾液皮膚封閉型斑貼實驗結果
⏵按照《化妝品安全技術規範》（2015 年版）規定，選取 30 名合格的受試者開展咖啡發酵濾液進行人体皮膚封閉型斑貼實驗，結果見表 2。可知，去除斑貼 30 min 後，發現有 1 例一級反應；24 h 後及 48 h 後，沒有受試者出現陽性，說明咖啡發酵濾液對皮膚基本無刺激性。
⑤與市售其他咖啡提取物對比
表 3 測試樣品信息
圖 5 不同產品中成分及抗氧化活性情況。（A）不同樣品的多肽含量對比；（B）不同樣品的多酚含量對比；（C）不同樣品的 DPPH 自由基清除率對比。
⏵為了更全面評估和驗證複合菌種發酵的咖啡濾液的效力，我們購買了市面上其他幾種咖啡提取物，進行了成分和活性的比較（測試樣品信息詳見表 3）。如圖 5 所示，與其他 5 種樣品相比，咖啡發酵濾液中多肽和多酚的含量最高，分別為 3.96 mg/mL 和 0.82 mg/mL。值得注意的是，在相同濃度下，咖啡發酵濾液（2.5% 濃度）的 DPPH 自由基清除率高達 92.02%。這些結果表明，經複合菌種發酵的咖啡濾液具有高活性成分和強抗氧化性的優勢。
03 研究結論Research Conclusions
本實驗以綠咖啡豆為研究對象，通過混合發酵法獲得了咖啡發酵濾液。我們優化了提取條件，並進行了與化妝品功效相關的研究。結果顯示，咖啡發酵濾液中的黃酮、多肽和總酚含量均高於市售產品。體積分數 2.5% 的咖啡發酵濾液對 DPPH 自由基的清除率達 92.02%，表明其具有出色的抗氧化活性。體外細胞實驗結果顯示，咖啡發酵濾液在抗衰老方面表現出顯著作用，能夠增加人皮膚成纖維細胞中膠原蛋白 -Ⅰ 和彈性蛋白的含量，同時降低 MMP - 1 的含量。皮膚封閉型斑貼實驗證明其基本無刺激性。這些研究結果為微生物發酵咖啡高功能價值新產品的開發和工業化生產提供了技術支持。
文中提及的咖啡發酵濾液已應用於 HBN 咖啡系列產品中，相關專利已申請。
作者署名：HBN 生物實驗室 王博士
文章審核人：HBN 生物實驗室 陳博士、盛博士
參考文獻：
[1] Rajasekhar T, 林斌。咖啡副產品利用的研究 [J]. 熱帶作物譯叢，1984, 6: 44 - 46.
[2] Ebrahimi - Najafabadi H, Leardi R, Oliveri P, et al. Detection of addition of barley to coffee using near infrared spectroscopy and chemometric techniques [J]. Talanta, 2012, 99: 175 - 179.
[3] Tong S S, Wang L, Jin J Y, et al. Correlation analysis of electronic tongue simulating civet cat coffee in vitro by enzymatic uncoupling fermentation [J]. Science and Technology of Food Industry. 2015, 36 (22): 133 - 142.
[4] 4.Wang C H, Sun J C, et al. Coffee flavour modification through controlled fermentation of green coffee beans by Lactococcus lactis subsp, cremoris [J]. LWT - Food Science and Technology, 2020, 120 (19): 1 - 21.
[5] Tapati Bhanja Dey, Subhojit Chakraborty, Kavish Kr Jain, et al. Antioxidant phenolics and their microbial production by submerged and solid state fermentation process: A review [J]. Trends in Food Science & Technology, 2016, 53 (7): 60 - 74.
